實驗中鎳親和層析影響因素之六聚組氨酸
時間：2022-05-14 11:57:02
點擊數：
目的研究六聚組氨酸在重組蛋白中的位置對鎳親和層析的影響。方法采用PCR法擴增目的基因,克隆人pMD18-T載體后進行序列測定。構建原核表達載體pET28-His-Cpn10-IL4與pET28-Cpn10-His-IL-4,在大腸桿菌菌株BL21(DE3)中表達兩種在不同位置帶有六聚組氨酸(His-tag)的重組白細胞介素4(rhIL-4)融合蛋白。用SDS-PAGE、Western印跡鑒定表達產物,采用鎳親和層析的方法純化兩種重組融合蛋白。結果Western印跡證實兩種融合蛋白均可與抗組氨酸單克隆抗體特異性結合,但用鎳親和層析方法可以很好地分離純化融合蛋白His-Cpn10-IL-4,卻不能純化融合蛋白Cpn10-His-IL-4。結論應用鎳親和層析的方法純化融合蛋白時,His-tag在融合蛋白中的位置對蛋白質的純化非常重要,His-tag可以在融合蛋白的N端和C端,但不能在中間。
以交聯瓊脂糖微球為基質,通過環氧氯丙烷活化,偶聯亞胺二乙酸并螯合N i2+,制備得到一種鎳離子親和層析介質。結果發現,在強堿條件下環氧活化率達到了38.0μmol/mL,最終N i2+配基密度達到了30.9μmol/mL,偶聯效率為81.3%。利用得到的鎳離子親和介質對基因工程大腸桿菌表達的組氨酸標記3-羥基丁酮還原酶進行了一步層析純化,酶活回收率達到了58.8%,純化倍數為2.1,蛋白純度在85%左右,純化效果與常用商品介質基本相當。
青島科諾賽生物科技有限公司專注于生物分子分離純化，業務有蛋白A親和層析,疏水層析，鎳親和，肝素親和，抗體/疫苗/重組蛋白純化等，現擁有研發及中試實驗室2000平方米，生產基地23000余平方米
