親和層析法分離純化動物腹水中抗體的實驗方法
基本原理： protein A和proteiin G 可以和抗體IgG分子的Fc段特異性結(jié)合。Protein A Chromrose TM4FF和Protein G ChromroseTM 4FF是專業(yè)偶聯(lián)耐堿重組Protein A和Protein G的高流速瓊脂糖層析介質(zhì)，當(dāng)動物腹水從層析柱中流過時，特異性的IgG就與層析介質(zhì)中的配基結(jié)合，其他雜蛋白則穿流而過。
因兩種蛋白純化抗體時對不同宿主的抗體的結(jié)合能力不同，我們需要具體情況具體對待，分別選擇protein A 或者protein G,或者是protein A/protein G組合。一般推薦小鼠單抗IgG2a,IgG2b,IgG3，兔，人，豬的多克隆抗體用protein A純化，而小鼠單抗IgG1, 大鼠單抗，小鼠，大鼠，山羊的多克隆抗體則選擇用protein G純化。
物種 | 亞類 | Protein A 結(jié)合 | Protein G 結(jié)合 | Protein L 結(jié)合 |
人 | lgG(常規(guī)） | +++++ | ++++ | ++++ |
lgG1 | +++++ | ++++ | ++++ | |
lgG2 | +++++ | ++++ | ++++ | |
lgG3 | - | ++++ | ++++ | |
lgG4 | ++++ | ++++ | ++++ | |
lgM | - | - | ++++ | |
lgA | - | - | ++++ | |
lgE | - | - | ++++ | |
lgD | - | - | ++++ | |
Fab | ++ | ++ | ++++ | |
κ輕鏈 | - | - | ++++ | |
L輕鏈 | - | - | - | |
ScFv | ++ | - | ++++ | |
雞蛋黃 | lgY | - | - | - |
雞 | IgG | - | + | ++ |
牛 | lgG | ++ | ++++ | - |
狗 | lgG | ++++ | ++++ | + |
山羊 | lgG | +/- | ++ | - |
豚鼠 | lgG1 | +++ | ++ | ++ |
lgG2 | +++ | ++ | ++ | |
倉鼠 | lgG | + | ++ | +++ |
馬 | lgG | + | ++ | ++++ |
考拉 | lgG | - | + | + |
駱駝 | - | + | + | |
猴(恒河) | lgG | ++++ | ++++ | ++++ |
小鼠 | lgG1 | + | ++++ | ++++ |
lgG2a | ++++ | ++++ | ++++ | |
lgG2b | +++ | +++ | ++++ | |
lgG3 | ++ | +++ | ++++ | |
lgM | 可變 | - | ++++ | |
豬 | IgG | ++ | ++++ | +/- |
兔 | IgG | ++++ | +++ | + |
大鼠 | lgG1 | - | + | ++++ |
lgG2a | - | ++++ | ++++ | |
lgG2b | - | ++ | ++++ | |
lgG2c | + | ++ | ++++ | |
綿羊 | lgG | +/- | ++ | - |
貓 | lgG | ++++ | - | N/A |
具體實驗步驟如下：
1. 根據(jù)要純化的抗體量選擇適當(dāng)?shù)膶游鲋?，推薦使用HiQumnTM CTN30型中高壓層析柱（內(nèi)徑10mm）或者HiQumnTM CXK10型層析柱（內(nèi)徑16mm）或者更大的層析柱
2. 將計算過合適體積的Protein A Chromrose TM4FF或Protein G ChromroseTM 層析介質(zhì)填裝到HiQumnTM 層析柱中，接入層析系統(tǒng)進行加壓，待流動相流過3個柱體積后，將HiQumnTM 層析柱柱頭調(diào)節(jié)桿調(diào)整到層析介質(zhì)下方2-3mm處固定
3. 通過層析系統(tǒng)泵入要純化的經(jīng)預(yù)處理了的動物腹水一個柱體積，流動相為結(jié)合液。建議流速CV/5min；
5. 用5倍柱體積的結(jié)合液平衡柱子；
5. 用5-10倍柱體積的緩沖液清洗層析柱，直到?jīng)]有樣本流出；
6. 用5-10倍柱體積洗脫液洗脫層析柱，并收集抗體；
7. 將所純化的抗體加入30%-50%的甘油置于-20攝氏度或者-80攝氏度即可長期保存。
圖1. 科諾賽HiQumn CTN30-10層析柱
圖2. 科諾賽Protein A Chromrose 親和層析介質(zhì)
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