超螺旋質粒DNA純化方案
隨著生物醫(yī)藥行業(yè)的不斷發(fā)展，我國細胞與基因治療領域研發(fā)與應用正加速崛起，高質量、高純度的質粒DNA是細胞和基因治療過程中的關鍵組成部分，質粒的純度會嚴重影響到轉染的效率，如果質粒不純，其含有的雜質會嚴重影響轉染復合體的形成。
如何提取高純度的質粒DNA
質粒DNA基因治療藥物是以質粒DNA為載體的基因治療產(chǎn)品，一般選擇大腸桿菌作為宿主細胞，提取出的質粒中DNA會以多種形式出現(xiàn)：超螺旋質粒DNA (scDNA) 、開環(huán)DNA (ocDNA) 、線性DNA 和質粒DNA聚集體等。另外，還伴隨有宿主蛋白 (HCP) 、宿主核酸 (HCD) 、RNA、內毒素等雜質。其中超螺旋質粒DNA（scDNA）是我們的目標產(chǎn)物，因為它的轉染和表達效率最高，然而其他DNA雜質也有與scDNA非常相似的純化特點，所以獲得高純度的質粒產(chǎn)物需要一個穩(wěn)定有效的解決方案。
質粒純化最好的方案是要有一個穩(wěn)健有效的整體過程，其中每一步都能得到很好的優(yōu)化。目前市場上應用比較更廣泛的是經(jīng)典的層析三步法，科諾賽生物對每一步層析工藝進行了優(yōu)化，將不同原理的層析純化技術、合適的層析介質結合在一起，進行了實驗應用研究，可保證在高純度的基礎上，工藝更加的穩(wěn)定及高效。
超螺旋質粒DNA純化三步法：
第1步 捕獲質粒DNA，去除RNA
（凝膠過濾層析 Chromrose 6FF）
第2步 去除ocDNA
（親和層析 Plasmid Chromrose HP）
第3步 去除痕量雜質及內毒素
（離子交換層析 MoSphere 50M Q）
質粒DNA純化方案及案例解析
第一步 凝膠過濾層析純化：捕獲質粒DNA，去除RNA
使用Chromrose 6FF凝膠過濾層析介質進行第一步純化，主要去除大量RNA和宿主蛋白等小分子雜質,根據(jù)分子大小的不同對不同的組群進行分離，由于質粒DNA和RNA的分子量差異很大，因此上樣量可以達到0.3CV，在純化時可同步進行緩沖液置換，直接與第二步親和層析純化進行無縫對接。
實驗條件
樣品：濃縮20×澄清堿性裂解液
層析柱：HiQumn CTN 30
層析介質：Chromrose 6FF
上樣量：0.3CV
緩沖液：2.1 M (NH4)2SO4，10 mM EDTA， 100 mM Tris-HCl，pH 7.5
凝膠過濾層析純化結果：Chromrose 6FF 回收率≥95%，電泳結果顯示樣品去除RNA≥95%。
第二步 嗜硫親和層析純化：去除開環(huán)質粒(ocDNA)
使用Plasmid Chromrose HP嗜硫親和層析介質進行第二步純化，ocDNA和scDNA分子性質高度相似，其中scDNA具有更高的堿基暴露程度和表面電荷，Plasmid Chromrose? HP嗜硫親和介質利用本身的特性可以特異性得將ocDNA和scDNA分開，提高質粒的均一性。經(jīng)過這兩步層析純化后，scDNA的純度可以提高到90%以上。
實驗條件
樣品：Chromrose 6FF后的質粒DNA
層析柱：HiQumn CTN 30
層析介質：Plasmid Chromrose HP
平衡緩沖液：2.0M (NH4)2SO4，10mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH7.5
洗脫緩沖液：0.3M NaCl，1.7 M (NH4)2SO4，10mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH7.5
注意：不同序列及大小的質粒，純化時緩沖液及載量要適當調整。
親和層析純化結果：Plasmid Chromrose HP 回收率可達90%，電泳結果顯示可實現(xiàn)對ocDNA和scDNA的完全分離，可獲得純度≥95%的scDNA。
第三步 離子交換層析純化：去除痕量雜質及內毒素
使用MoSphere 50M Q 陰離子交換層析介質進行第三步精純，去除痕量雜質和內毒素。經(jīng)過前兩步層析純化后，scDNA純度和均一性基本滿足了生產(chǎn)需求，但依然存在內毒素的隱患，此步驟主要是利用內毒素在高鹽條件下不與介質結合的原理，除去樣品中的內毒素，PolyGel 30Q的對本樣品質粒收率有85%。
實驗條件
樣品：Plasmid Chromrose HP后的質粒DNA
層析柱：HiQumn CTN 30
層析介質：MoSphere 50M Q
平衡緩沖液：0.4M NaCl，10mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH7.5
洗脫緩沖液：1.0M NaCl，10mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH7.5
離子交換層析純化結果： MoSphere 50M Q 對樣品的回收率約為83%，內毒素含量1.2EU/mg(scDNA)
總結：
科諾賽生物的質粒純化三步法被證實是穩(wěn)健有效的方案，實用性強。隨著工藝的不斷發(fā)展，我們也會不斷的去優(yōu)化工藝、升級產(chǎn)品，幫助客戶提高生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)成本，切實地為國內的細胞與基因治療出一份力。
