超大孔填料在病毒樣顆粒（VLP）疫苗純化中的應用

VLP作為一個更具前景的載體工具，被廣泛應用于基因治療、疫苗研發和診斷等領域。相對于傳統疫苗，VLP疫苗的安全性更高、免疫效果更好。在VLP疫苗的大規模生產中，下游層析工藝對最終產品的穩定性、安全性及有效性起到至關重要的作用。

VLP的特別之處

VLP（Virus Like Particle），病毒樣顆粒，來源于病毒的外層衣殼蛋白，由一種或者多種衣殼蛋白組分自動組裝形成的納米級別的微小顆粒。VLP顆粒由病毒衣殼蛋白自組裝而成，不含有病毒基因組，此特殊的空間結構能強烈地刺激人體的免疫系統，有效地誘導人體產生免疫保護反應。其優勢如下：

• 安全性高：VLP不含復制酶和編碼病毒結構蛋白的核酸，缺乏復制能力，不會傳染，安全性有保障；

• 免疫效果好：VLP作為大小在40 - 200nm的抗原，可迅速排入淋巴結（LNs），并與抗原提呈細胞（APCs）和B細胞相互作用，有效刺激B細胞和T細胞反應。

• 表達系統多樣性：大腸桿菌、酵母、哺乳動物細胞、昆蟲細胞和植物等多種表達體系可用于表達VLP。

• 技術成熟，已經商業化：據文獻資料顯示，目前已上市的基于VLP病毒樣顆粒的疫苗有包括2價、4價、9價的人乳頭瘤病毒（HPV）疫苗、乙型肝炎病毒（HBV）疫苗、戊型肝炎病毒（HEV）疫苗以及瘧疾疫苗。更多基于VLP的候選疫苗正在進行臨床前和臨床試驗。

VLP的包膜結構

VLP主要分為eVLP和非包膜VLP，兩者最大的區別就是在蛋白質衣殼外是否有一層包膜。

非包膜VLP：由單個或多個衣殼蛋白組成的結構相對簡單的 VLP，可以在原核和低級真核系統中表達，例如：戊肝病毒、HPV病毒、手足口病毒。

包膜VLP（eVLP）：以矩陣形式包裹在來源于宿主的含有糖蛋白的脂膜中，結構復雜，構建難度大，但可設計性更強。通常在真核表達系統表達，需要共表達幾種結構蛋白用于細胞內的自組裝過程。例如：乙肝病毒、流感病毒、冠狀病毒。

VLP疫苗純化中的挑戰

VLP疫苗盡管優勢明顯，市場潛力巨大，但是目前仍然存在某些方面的局限及困難，尤其是產品純化方面，VLP 的宿主細胞衍生膜能夠整合抗原和佐劑，與此同時，也存在多種與工藝相關的宿主細胞雜質，產品收率低（特別是包膜VLP），加上縮短上市時間及高昂的開發成本等壓力，都在一定程度上導致了工藝開發的不足，為下游工藝開發帶來了極大的挑戰。

目前市場上已有的純化工藝，大都采用普通的層析介質，或多或少都有一定的局限性。

與其他生物分子相比，VLP病毒顆粒最大的特點在于其多聚亞基的大顆粒結構，且分子尺寸較大（直徑20~800nm），普通的瓊脂糖微球和聚合物微球孔徑較小，病毒顆粒不能有效的進入微球內部而導致結合載量及其低，同時狹窄的孔徑會導致其以擴散的方式通過，傳至速度慢，處理量低，耗時長，且會破壞病毒顆粒的結構使其解聚，活性降低，從而影響回收率。

科諾賽經過充分的市場調研，聚焦VLP純化中的難點，結合自有的超大孔色譜分離技術（孔徑大于200nm），提出了VLP純化的解決方案，并成功地實踐應用，為客戶解決了問題。

VLP疫苗純化推薦方案

純化策略的主線 - 澄清、捕獲、純化和精純。 

在收獲和裂解細胞后，為了確保去除污染的細胞碎片和聚集體，需要進行澄清。為了獲得完整和更純凈的VLP，需要再進一步分離純化。

病毒樣顆粒 VLP的下游純化工藝因表達體系的不同，存在不同的純化策略，其中Crysto Shell 700 / 400復合模式層析填料和MoSphere 50V Q / DEAE超大孔層析介質，因其獨特的結構特點在 VLP 純化工藝開發中占據優勢地位。
VLP粒徑較大，優先考慮Crysto Shell 700，VLP粒徑較小，優先考慮Crysto shell 400，具體需要根據試驗結果平衡收率和純度來綜合考慮。
而在精純步驟，由于病毒顆粒較大，MoSphere 50V Q / DEAE超大孔層析介質，是最佳選擇。

VLP純化 方案一

第①步 復合模式層析純化：

使用Crysto Shell 700 / 400（陰離子交換與疏水雙重功能）復合模式層析介質，吸附宿主細胞雜質，VLP分子量大，排阻在外直接流穿，此步驟可以去除 85% 的宿主蛋白。

PS：Crysto Shell 相比 Capto Core 孔徑更小，可確保回收率。

第②步 離子交換層析純化：

使用MoSphere 50V Q / DEAE超大孔陰離子交換層析介質，進行精純。

VLP純化 方案二

第①步 復合模式層析純化：

使用AdMix Chromrose FF（陰離子交換與疏水雙重功能）復合模式層析介質，吸附宿主細胞雜質，VLP分子大，排阻在外直接流穿，此步驟可以去除 80% 的宿主蛋白。（VLP粒徑＞80nm適用）

第②步 離子交換層析純化：

使用MoSphere 50V Q / DEAE超大孔陰離子交換層析介質，進行精純。
PS：此方案較【方案一】成本更低，可作為節省成本的替代方案。

包膜VLP純化應用案例 

項目背景： 客戶樣品為有包膜的病毒抗原VLP疫苗，篩選了市場上多家填料均無法滿足要求，只有某進口品牌的強陰離子介質能夠滿足其結合要求，沒有流穿，但載量較低。 客戶更換為科諾賽超大孔離子交換介質后，在高鹽的情況下，不僅結合性好，載量也有所提升，完全能夠實現填料國產化替代。

科諾賽產品：MoSphere 50V Q  超大孔陰離子交換介質

項目進展：中試 。

測試結果：

采用科諾賽 MoSphere 50V Q 超大孔離子交換介質，在高鹽條件下上樣，沒有流穿出現。
VLP疫苗純化的方案不止以上這幾種，來自同一家族病毒的VLP可能具有復雜的表面特性。例如，不同毒株的流感VLP在表面抗原上有差異，這就需要因地制宜地調整純化策略。

總的來說，科諾賽的MoSphere 50 系列超大孔層析填料，在病毒顆粒（VLP）疫苗下游分離純化工藝中是必不可少的、最有效的分離載體之一。

匹配市場需求的產品才有價值

科諾賽的超大孔填料，已經被廣泛應用于病毒、VLP、AAV載體、質粒、外泌體、mRNA及超大蛋白分子的分離純化中，并且充分顯示出了其在純化方面的優越性，成功了幫助客戶解決了一個個純化難題，切實地幫助客戶實現降本增效。